1933年2月，日本侵略军分兵三路进攻热河，第二十五师奉命从徐州、蚌埠一带开往通县集结，阻击敌人。3月9日，第二十五师到达石匣镇后，杜聿明和关麟征驱车往古北口，与东北军军长王以哲联系。杜聿明代理师长职务，指挥该师官兵，同日寇浴血奋战。1933年3月12日，杜奉命将阵地交与第二师。同年秋，杜聿明进入南京中央军校开办的高等教育班第一期进修。学习期间，经同乡、黄埔一期同时毕业的马志超介绍，参加了复兴社。
1936年春，杜聿明从中央军校高级教育班毕业。杜本应返第二十五师供职，但由于和师长关麟征相处不甚和谐，不太愿回去。徐庭瑶即向蒋介石保荐他到新成立的南京陆军交辎学校担任学员队队长，负责培训指挥机械化部队作战的军官。10月5日授予少将军衔。
1937年，交辎学校战车营、交通兵第二团所属装甲汽车队合编，并补充一批战车，建成国民党军第一个陆军装甲兵团，杜聿明委为第一任团长。“八·一三”淞沪抗日时，杜率领装甲兵团第一营的二、四两连，在上海汇山码头协同步兵阻击企图登岸的日军。
抗日战争
1938年，装甲兵团撤至湖南湘潭整训，不久该兵团扩编为第200师，以杜聿明为师长。长沙大火后，国民党长沙市警察局人员与放火队员，又来到湘潭城下，欲火烧湘潭城。杜聿明得知后，当面怒斥了这种惊慌失措，草菅人命的做法，随派员收缴了放火队的器械，将放火的人强行控制看管，并张贴布告，严禁放火焚烧湘潭县城，这才使湘潭城池数十万人的生命和财产得以保全。事后，湘潭万民同声称颂，感激杜聿明与二百师的救城之恩。
1938年12月，第二百师扩编成新编第十一军，从湖南湘潭移驻广西全州，杜聿明委为副军长。不久，番号又改为第五军，杜升任军长。该军是国民党政府在抗日战争初期成立的唯一机械化新军。杜提出：“操场就是战场”，“平时多流汗，战时少流血”，要求新军具有“五除”（除骄、惰、伪、欲、恶）、“三习”（习精、诚、勤）的朝气。
1939年夏起，日本侵略军集结兵力，准备开辟华南战场。1939年11月17日，日寇在防城、北海登陆，进占钦州，19日，又突破小董防线，向南宁进击。杜聿明的第五军奉命从全州向南宁附近集中，准备攻击由钦州、防城登陆的北进之敌。面对日寇气势汹汹的进攻，杜聿明冷静地分析了当时的战局，估计了敌人的弱点，向重庆最高统帅部提出了自己的建议：“乘敌孤军深入后援未济之时，集结优势兵力，配合地方民众，迅速反攻，以击破侵敌而恢复国际之重要交通。”
1939年12月16日晨，杜聿明奉命率第五军担任对邕宾路的正面攻击，意在先行击破昆仑关及八塘附近之敌。杜召集团长以上会议，宣读作战部署：以郑洞国荣誉第一师从正面进攻；戴安澜第二百师为总预备队；邱清泉新编第二十二师迂回敌后进出南宁以北；向六塘守敌攻击，以截断南宁、昆仑关交通联络，孤立昆仑关之敌。第二天，白崇禧和陈诚到谭蓬村第五军司令部视察。陈严令杜要如期攻克昆仑关，直下南宁。
1939年12月18日拂晓，反攻开始。在战车、炮火掩护下，杜聿明第五军对昆仑关守敌进行了猛烈的攻击。戴安澜师与日寇展开白刃战，首先占领了仙女山。当晚各部乘胜进行夜袭，相继占领了老毛岭、万福村、441高地，最后占领了昆仑关。杜聿明在此期间，采取“要塞式攻击法”，逐步缩小包围圈，一口一口地吃掉敌人。杜聿明命令第二百师副师长彭璧生率部从公路左侧越过昆仑关，形成包围之势；邱清泉师把战车埋伏在公路两旁的丛林地带；郑洞国师则加强右翼攻势，再度进入昆仑关内敌军纵深阵地，将敌指挥部及炮兵阵地摧毁。战斗整整打了十八天，于31日以中国军队获重大胜利而告结束，史称昆仑关大捷。
1941年2月，杜聿明作为中缅印马军事考察团成员，赴缅甸、印度、马来西亚作军事考察。
1942年初，日军第十五军饭田祥二郎率四个师团分两路向缅甸进攻。中国派出远征军，杜聿明为第一路副司令长官。中国和英国军队集结后，策定作战计划，分三路南下迎击日军。杜聿明第五军为中路军，于3月9日接替英缅军在同古的防务。
1942年3月20日，同古诸战开始，一连数日，敌陆、空配合并与炮兵、战车协同进攻。至26日，正面敌人以其三个联队向同古西北角猛攻，第二百师第六团阵地被突破；27日，新编第二十二师到达同古以北，与敌遭遇，双方彻夜对峙。28日，日军北守南攻，在同古北修筑工事，企图阻止新编第二十二师前进，而集中主力猛攻第二百师，并施放糜烂性毒气，第二百师官兵伤亡甚重。杜聿明即指挥新二十二师对当面之敌施行猛攻，进占南阳车站，以解第二百师之围，但日军凭借附近建筑物固守。两军反复争夺，激战至30日。
